Nació en Valladolid el 22 de septiembre de 1601 y fue la primogénita de Felipe III de España y de Margarita de Austria.

Cuando sólo tenía 10 años murió su madre y al cumplir los 14 se casó por poderes en Burdeos con el que sería Luis XIII.

Tuvo una serie de devaneos sentimentales con el Duque de Buckingham que la llevaron a recluirse en Val-de-Grace separándose de su marido. Desde allí, conspiró en contra del Cardenal Richelieu.

A la muerte de Luis XIII, el Parlamento de París hizo caso omiso del testamento del difunto rey y la nombró regente del reino hasta la mayoría de edad de su hijo, Luis XIV de Francia.

Ana de Austria entregó el gobierno al Cardenal Micerino, con quien se creyó que había contraído nupcias, y a quien apoyó en todas sus iniciativas. Fue una partícipe activa en el matrimonio de su hijo Luis XIV con su sobrina María Teresa de Austria, hija de su hermano Felipe IV, de cuya unión nació Luis, al que la historia le guardó el sobrenombre de el Gran Delfín (1661-1711), ya que nunca llegó a reinar al morir antes que su padre.

Con la mayoría de edad de su hijo en 1661, cesó su actividad política. Muriendo en el Palacio del Louvre el 20 de enero de 1666.